brigatinib（AP26113）联合抗EGFR单抗治疗AZD9291耐药

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2017-03-24 秧苗翻译
Brigatinib combined with anti-EGFR antibodyovercomes osimertinib resistance in EGFR-mutated non-small-cell lung cancer
NATURE COMMUNICATIONS | 8:14768 | DOI: 10.1038/ncomms14768|www.nature.com/naturecommunications
Osimertinib（AZD9291）已被证实能抑制表皮生长因子受体(EGFR)-T790M,第一代EGFR最相关的获得性耐药酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)。然而,C797S突变削弱了EGFR和osimertinib在797位置共价半胱氨酸残基之间的结合，诱发osimertinib耐药。目前,没有有效的治疗策略来克服C797S/T790M/EGFR 激活突变(EGFR三突变)介导EGFR-TKI耐药。在目前的研究中,我们确定brigatinib（AP26113）在体外和体内对EGFR三突变是有治疗效果。我们最初的计算模拟表明brigatinib符合三突变EGFR的磷酸腺苷ATP的结合位。结构活性关系分析揭示了brigatinib关键组分抑制EGFR三突变。通过与anti-EGFR抗体联合，brigatinib抑制效果显著增强，是因为减少的细胞表面和总EGFR表达。因此,联合治疗Brigatinib联合EGFR抗体是一种克服EGFR三突变强有力的治疗办法。
EGFR-C797S/T790M/三突变药物耐药。
当前，有4种EGFR–TKIs临床使用，分别是吉非替尼gefitinib, 厄洛替尼erlotinib, 阿法替尼afatinib和奥西替尼osimertinib. Gefitinib和erlotinib是第一代EGFR–TKIs，用于NSCLC患者有EGFR突变(EGFR激活突变; 外显子19删除[del19] 或外显子21 L858R点突变[L858R]). Afatinib是二代EGFR–TKI，不可逆地靶向泛HER信号通路.Osimertinib和EGF-816是第三代EGFR–TKIs ，通过共价结合EGFR及有效拮抗T790M突变的EGFR, T790M突变是第一代 EGFR–TKIs最常见的获得性耐药突变. EGF-816仅处于临床试验阶段. 所有类型的EGFR-TKIs对只有EGFR激活突变都有效.因此，
我们引入Ba/F3 细胞系(T790M/激活突变或C797S/T790M/激活突变 (三突变))，评估EGFR–TKI耐药突变的敏感度，包括gefitinib,
afatinib, osimertinib和EGF-816.
CellTiter-Glo分析显示gefitinib和afatinib对EGFR激活突变是有效的,也对C797S突变有效, C797S 共价结合于二代和三代EGFR–TKIs. 不过，它们对T790M看门突变没有效果，T790M是第一代EGFR–TKIs最常见的耐药机制. Osimertinib和EGF-816显示不仅对EGFR激活突变有效，而且对EGFR/T790M也有效。虽然T790M突变引起的耐药被第三代 EGFR–TKIs所克服,而C797S与T790M順式突变使它们失去了活性。与父系细胞一样表达EGFR三突变的Ba/F3 细胞系最终对一到三代类似IC50值（一半的抑制浓度）EGFR–TKIs耐药。我们检查PC9细胞 (父系;只del19)和耐药PC9细胞(T790M;双突变del19与 T790M, 三突变; C797S/T790M/del19(三个del19)突变EGFR)对EGFR–TKIs的敏感度来确定Ba/F3细胞的特征。 CellTiter-Glo分析揭示PC9 三突变细胞对使用EGFR–TKIs耐药类似于Ba/F3细胞。有趣的是， PC9 三突变细胞对gefitinib和osimertinib联合治疗也不敏感，本打算用于反式克服由C797S和T790M 介导的osimertinib 耐药。这些结果提示没有临床有效的药物用于治疗EGFR 三突变。
Brigatinib克服EGFR 三突变耐药。
调查合适药物克服EGFR 三突变。我们使用CellTiter-Glo执行一个专注的药物筛查寻找哪些药物能够治疗EGFR-del19突变的Ba/F3细胞。30种药物用于分析，既包括临床可用或临床实验阶段的EGFR–TKIs 也包括靶向其他酪氨酸激酶或丝氨酸/苏氨酸的激酶抑制剂，以显示是否可用重新使用一些抑制剂来治疗疾病或耐药的突变激酶。在这些TKIs中, 只有brigatinib和ponatinib在100nM对EGFR三突变具有约50%期望的抑制活性。不过， ponatinib与父系Ba/F3细胞具有同样IC50却没有抑制能力。然后，使用CellTiter-Glo分析评估了brigatinib在 T790M/del19 和EGFR 三突变Ba/F3 细胞中的疗效。分析说明了只有brigatinib以低IC50（<100nM）抑制表达EGFR 三突变Ba/F3细胞的生长。只有增加白介素IL-3作为一条原有的生存信号通路激活因子才能抵销brigatinib的抑制效果. Brigatinib对EGFR 三突变疗效被免疫印迹所确定。与afatinib和osimertinib缺乏EGFR磷酸化抑制相比，免疫印迹显示Brigatinib对EGFR及其下游信号通路以剂量有关的方式降低磷酸化。在只表达EGFR-del19，T790M/del19 或C797S/del19 Ba/F3细胞中，虽然brigatinib显示可接受的细胞生长和EGFR信号通路抑制活性，也只优于osimertinib抗C797S/del19.同样，brigatinib对L858R突变的EGFR(只L858R,T790M/L858R, C797S/L858R，C797S/T790M/L858R (三L858R))显示疗效，但比EGFR-del19差。
为评估brigatinib是否通过ATP竞争对EGFR起作用，通过比较 EGFR 三突变和野生EGFR体外的激酶分析,表明brigatinib竞争性地影响EGFR 激酶域ATP结合位点. 通过IC50值是10 mM，比L858R 三突变低10倍，证明Brigatinib对EGFR 三突变具有更高的抑制能力。而且, brigatinib显示对没有EGFR突变的细胞系没有抑制活性，不同于afatinib和osimertinib。在 KRAS突变的A549 或 H460细胞,
所有的抑制剂都有高IC50值. 根据这些结果,brigatinib比afatinib或osimertinib毒性更低。
Brigatinib体内治疗 EGFR 三突变的疗效.
为确认Brigatinib抗EGFR 三突变出众的活性，我们在裸鼠体内皮下注射EGFR del19三突变(PC9三突变)，然后服用brigatinib或osimertinib，结果是， brigatinib治疗的老鼠显示明显抑制PC9三突变细胞的生长，而对照osimertinib治疗没有明确的肿瘤细胞毒性。老鼠肿瘤样本中EGFR及其下游的信号通路的磷酸化被brigatinib 所抑制。Ba/F3 细胞也显示同样的结果。值得注意的是, osimertinib(50 mg/kg) 和 brigatinib (75 mg/kg)都成功抑制T790M/del19表达的PC9细胞。这些结果表明brigatinib利用三突变而不是细胞类型，是克服第三代EGFR TKI的有希望的候选药物。
抗-EGFR抗体加强brigatinib治疗效果.
以前有报道afatinib+cetuximab对第一代EGFR TKI获得性耐药有效果，我们评估了 brigatinib和cetuximab或panitumumab抗EGFR三突变的疗效。使用Cell-Titer Glo kit 分析细胞活力，显示cetuximab以低约3倍IC50值增强brigatinib或AP26113类似药物抗EGFR del19三突变 Ba/F3细胞的效果，而osimertinib联合却没有达到协同效果。通过使用western blotting，下游信号通路被brigatinib 和cetuximab联合抑制。其他抗EGFR抗体panitumumab 联合brigatinib也有类似抑制效果。
为进一步了解联合抗EGFR抗体的治疗效果，我们使用PC9三突变细胞分别用cetuximab,brigatinib，brigatinib+cetuximab治疗PC9三突变细胞,在0, 6, 24，48 小时后，评估细胞表面的EGFR表达。使用流细胞术分析，显示brigatinib+cetuximab治疗的细胞表面EGFR水平随时间流逝而明显下降。而单药cetuximab只是适度的下降。单brigatinib却没有下降（评：单药没有降低EGFR表达不就是无效吗？）。同样的实验在EGFR del19三突变的MGH121-res2细胞有同样的结果。实验表明协同cetuximab诱导EGFR退化，增强brigatinib效果。然后，我们进行体内实验，肿瘤类型PC9三突变异种移植，比较对照组，单brigatinib组，单osimertinib组，单cetuximab组，brigatinib+cetuximab组。与其他组相比，尤其是osimertinib组，brigatinib+cetuximab显示明显的肿瘤生长抑制而没有毒副作用以及生存期的延长。我们确定联合治疗效果取决于抑制EGFR磷酸化和降低EGFR表达。brigatinib+Panitumumab也具有类似的治疗效果。