肿瘤的异质性( 肺癌篇 ）

肿瘤的异质性
研究表明NSCLC的肿瘤组织中存在基因突变的异质性，即一个肿瘤中部分细胞为EGFR突变型，部分为EGFR野生型。2011年JCO杂志报道显示，肿瘤中EGFR突变的量可预测EGFR TKI疗效，EGFR突变量高的患者比EGFR突变率低的患者和EGFR野生型的患者更能从EGFR-TKI的治疗中获益。另一篇关于肿瘤突变异质性的文章2012年发表在PLOS ONE杂志上，将45例EGFR突变型患者的肿瘤组织经显微切割成1431个组织块，对这些组织块分别进行EGFR突变检测，其中21例（47%）患者的肿瘤组织为纯的EGFR突变型，24例（53%）的患者肿瘤组织中存在突变的异质性（即部分组织块为EGFR野生型）。同样的40例EGFR野生型的患者的肿瘤组织也进行了相似的检测，其中36例（90%）患者的肿瘤组织为纯的EGFR野生型，4例患者（10%）存在突变的异质性（即部分组织块中检测到EGFR突变）。该研究通过DHPLC及ARMS两种方法检测EGFR复合突变的发生率分别为32.9%和28.2%，再次说明肿瘤异质性的存在。2012年发表在Cell杂志上的一篇文章解释了肿瘤异质性产生的原因：如果一个肿瘤的所有细胞均来自同一个克隆，则EGFR突变状态单一；而如果一个肿瘤由来自不同克隆的细胞组成，不同克隆间EGFR突变状态不同，就可能导致肿瘤异质性的产生。


EGFR-TKI耐药机制你了解吗？
EGFR-TKI药物是目前治疗EGFR突变型非小细胞肺癌指南推荐的一线标准，但EGFR敏感突变的患者选择EGFR-TKI治疗仍有30%原发耐药，且大多患者治疗8-14个月左右会出现继发耐药。如何深入理解耐药机制，选择合适的治疗手段是临床医生需面对的问题。  
1976年，Nowell[1]在《Science》发表文章提出“肿瘤细胞进化”的概念。肿瘤通常起源于一个正常细胞的恶变。这个癌变的细胞由于基因组的不稳定性和肿瘤微环境的作用在传代过程中会不断进化，即不断有新的基因突变产生。这是同一瘤体内异质性产生的根源。2012年，Timothy[2]等把瘤内异质性比喻为一棵不断生长的树。“树干”由占主导地位的驱动基因突变构成，其遗传信息存在于每个肿瘤细胞中，定义靶向治疗药物的敏感性和原发耐药；不同“树枝”间的基因突变谱不同，即同一瘤体内存在不同亚群，决定靶向药物的继发耐药机制由于肿瘤异质性的存在，在使用激酶抑制剂类的靶向药物后，部分癌细胞会发生通路的再激活，就导致耐药。如果再激活的通路由靶激酶的突变引起，可使用针对该靶点的新一代药物，或者联合用药；如果再激活由旁路机制引起，可选择联合旁路抑制的靶向药物。
在EGFR敏感突变但是对TKI原发耐药的患者中，人们发现，除了EGFR敏感突变，还可能存在其他EGFR突变或通路异常。包括：
1、同时存在T790M突变[3]；
2、抑癌基因PTEN的缺失或PIK3CA突变导致PI3K/AKT通路的异常激活[4,5]；
3、与IGF1R 通路的crosstalk[6]；
4、NFκB通路的激活[7]；
5、促凋亡蛋白BIM基因多态性的缺失[8]。
上述与EGFR敏感突变同时存在的突变或通路异常导致肿瘤对TKI的敏感性下降。而且，这些异常是肿瘤细胞进化过程中的早期基因改变，即“树干”的遗传学信息。
EGFR-TKI的继发耐药机制目前认为主要分为3大类：
1、EGFR第二位点T790M突变；
2、旁路激活；
3、表型转化。
此外，仍有15%-20%的耐药机制不明。大约50%-60%的EGFR-TKI继发耐药是EGFR T790M突变导致。T790M突变所致的蛋白质空间结构异常使第一代TKI不能很好的结合到EGFR酪氨酸激酶区，阻止了TKI发挥抑制EGFR通路的作用；此外，T790M突变增加了EGFR酪氨酸激酶与ATP的亲和力因此T790M突变导致了对第一代EGFR-TKI的耐药。2016年， Aaron[9]等发现，T790M突变既可能是原本就存在于瘤体内的亚群，对TKI敏感的细胞凋亡后被筛选出来的，也可能是使用TKI后由于肿瘤细胞进化新出现的突变。EGFR旁路的激活包括MET、HER2扩增，PIK3CA突变、BRAF突变等， 整体约占TKI获得性耐药机制的20%。表型转化包括向小细胞肺癌转化和上皮-间质转化（EMT），这部分分别占10%和2%左右，有研究认为，RB1和TGF-β分别介导了上述表型转化。
虽然对EGFR-TKI的临床应用和耐药机制的研究近10年取得了长足进步，但仍有15%-20%第一代TKI的耐药机制不明，对耐药的根源肿瘤基因异质性的探索及治疗仍有很长的路。在目前已知的EGFR-TKI原发和继发耐药机制中，T790M突变尤其重要，因此临床上应对其检测给予关注，对于监测疗效和指导后续治疗提供更多信息。

参考文献：
1.Peter C. Nowell. The Clonal Evolution of Tumor Cell Populations. Science. 1976 Oct 1;194(4260):23-8.
2.Yap TA, Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity: seeing the wood for the trees. Sci Transl Med. 2012 Mar 28;4(127):127.
3.Inukai M, et al. Presence of epidermal growth factor receptor gene T790M mutation as a minor clone in non-small cell lung cancer. Cancer Res2006;66:7854-8.
4.Sos ML, et al. PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR. Cancer Res 2009;69:3256-61.
5.Engelman JA, et al. Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J Clin Invest 2006;116:2695-706.
6.Sharma SV, Lee DY, Li B, et al. A chromatin-mediated
reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations.
Cell 2010;141:69-80.
7.Bivona TG, et al. FAS and NFκB signalling modulate dependence of lung cancers on mutant EGFR. Nature 2011;471:523-6.
8.Gong Y, et al. Induction of BIM is essential for apoptosis triggered by EGFR kinase inhibitors in mutant EGFR-dependent lung adenocarcinomas. PLoS Med 2007;4:e294.
9.Hata AN, et al. Tumor cells can follow distinct evolutionary paths to become resistant to epidermal growth factor receptor inhibition. Nat Med. 2016 Mar;22(3):262-9.


EGFR与EML4-ALK基因突变共存型非小细胞肺癌1例
近年来，驱动基因是非小细胞肺癌（NSCLC）研究的热点，尤其在肺腺癌，已经取得了可喜的成果。其中表皮生长因子受体（EGFR）、棘皮动物微管样蛋4⁃间变淋巴瘤激酶（EML4-ALK）及K⁃Ras等基因的研究结果逐渐改变了人们对NSCLC发生、发展生物学本质的认识，针对上述靶点的靶向干预，可以说是NSCLC 治疗史上一个重要“里程碑”。然而，随着越来越多驱动基因被相继发现，NSCLC是由单个驱动基因主导，还是双驱动基因或者多驱动基因共同演绎等问题，正困扰着目前的研究者及临床实践，进一步探索或寻找更多证据解答上述问题，是该领域的当务之急。现报告1例EGFR基因突变与EML4-ALK重组共存的患者，希望对这类患者的治疗提供一定的指导。

病案摘要

患者男性，68岁。因“反复咳嗽3个月，进行性加重伴胸闷1周。于2013 年5月27日就诊于我院。既往高血压病史20年；无吸烟、饮酒史；否认家族中有肿瘤患者。

PET-CT检查示：左下肺门占位，考虑中央型肺癌伴阻塞性炎症、不张；两肺内多发转移；左下胸膜及左颈根部、左侧锁骨上窝、纵隔内、左肺门多发肿大淋巴结，肝脏、多发椎体及附件骨转移；左下胸腔积液；颅内多发转移灶。癌胚抗原（CEA）404.8 ng/ml。左颈部淋巴结切除活检，组织病理免疫组化（图1）示：TTF-1（++++）、CK7（++++）、Ki-67（40%）、p53（+）、ALK（++）、CK5/6（-），支持实性腺癌来源于肺部。扩增阻滞突变系统多聚链酶式扩增（ARMS-PCR）法检测显示，EML4-ALK（外显子13，6a/b、20） 位点融合，EGFR 基因19（del）位点突变。


图１ EGFR与EML4-ALK基因突变共存型NSCLC患者的常规病理染色（HE×200）及免疫组化染色（SP ×200）

2013年6月28日开始接受厄洛替尼（150 mg/次，口服，1次/日）治疗；7月30日复查胸腹CT示：肺内、肝内病灶增大、数目增多，锁骨上、下淋巴结增大（图2）。按照RECIST1.1疗效评价标准评价为疾病进展，改用克唑替尼（250 mg/次，口服，２次/日）治疗，口服2个月后，疗效评价为稳定。患者目前仍在随访中。


图２　EGFR与EML4-ALK基因突变共存型NSCLC患者厄洛替尼治疗前、后的CT增强扫描影像

讨论

NSCLC 中单纯EGFR 的突变率为40％～60％，突变型患者的预后较野生型差，EGFR突变人群主要为亚裔女性、既往无或者轻度吸烟者、腺癌患者。2007年首次在NSCLC 中发现ALK重排，之后发现NSCLC 单纯ALK重排的发生率为3％～13％。重排型患者的预后比无重排型患者差，ALK重排患者的临床病理特征与EGFR 突变者相似，但又有其独特的病理特征，如印戒细胞成分、黏液筛孔状结构和显著的细胞外黏液成分分泌。多项研究显示，NSCLC中EML4-ALK重排与EGFR 及K⁃Ras突变是互为独立的、不共存的分子事件。最近发现ALK重排和EGFR 突变在同一肿瘤组织中共存，其发生率为1％～6％，目前共存型患者的病理临床特征以及预后缺乏相关循证医学证据。EGFR 与EML4-ALK 基因突变共存型NSCLC 患者的靶向药物（EGFR⁃TKIs和ALK抑制剂）如何优化，尚缺乏统一的共识。

从目前的个案报道中，我们发现大多数患者优先选择EGFR⁃TKIs，进展后再换用ALK抑制剂。EGFR⁃TKIs是单纯EGFR 突变的晚期NSCLC 患者的一线用药，其有效率为70％～80％，且无进展生存时间达９～14个月 ；然而共存型患者对EGFR-TKIs的敏感性不一致。Chen等报道1例EGFR 基因19位点缺失、ALK无重排的患者，接受厄洛替尼治疗11个月后出现进展，第2次活检行颈部淋巴结活检分子病理提示EGFR 基因19位点缺失、ALK重排，提示ALK 重排可能是EGFR⁃TKI 获得性耐药的一个机制。lee等报道了共存型患者对EGFR-TKIs 治疗无反应。

本例患者对厄洛替尼亦不敏感，说明ALK 重排也可能是EGFR-TKIs 原发耐药的一个机制。然而，有学者报道接受EGFR-TKIs 治疗前明确为共存型的患者对EGFR-TKIs治疗均有反应，但后期均出现对EGFR-TKIs耐药，其耐药机制尚未见报道。ALK重排是预测克唑替尼疗效的一个生物标记物，对于单纯ALK重排患者，使用克唑替尼的客观缓解率为65.3％，而共存型患者对于ALK 抑制剂的敏感性目前尚不清楚。

目前研究报道共存型患者接受EGFR-TKIs治疗进展后，更换为克唑替尼治疗，均对ALK 抑制剂敏感。然而体外实验研究表明，EGFR 信号通路异常活化是ALK 抑制剂对细胞的耐药机制之一。上述两种情况相矛盾，因此有必要进一步探索共存型患者对ALK 抑制剂敏感性的研究。

总之，由于报道较少，共存型患者的分子病理特点是由肿瘤本身存在异质性或者细胞生物特性引起，还是检测手段导致假阳性的出现目前尚不清楚。在靶向药物治疗的优化上，大多数倾向优先选择EGFR-TKIs，进展后再给予患者ALK 抑制剂，必要时再行病理检测。今后应该更侧重对共存型患者生物学行为及相关临床病理特征和共存型患者对EGFR-TKIs 和ALK 抑制剂敏感性不一致原因的研究，以及如何更好地优化靶向药物的选择；同时目前报道的检测手段不一致，有导致假阳性发生的可能，因此对于共存型患者检测手段的探索也是非常必要的。
http://case.medlive.cn/cancer/case-article/show-66211_55.html


研究者视角：NSCLC瘤内异质性研究 JCO之路
作者：蔡微菁、林冬梅、武春燕、李雪飞、赵超、郑立谋、揣少坤、费苛、周彩存、Fred R.Hirsch
通讯作者：周彩存
采访对象：蔡微菁（此研究第一作者）
肿瘤资讯： 您的研究主要是关注了非小细胞肺癌之中驱动基因的瘤内异质性的问题，您能向我们简要介绍下您在这个研究中的重要发现吗？
蔡微菁博士：首先，我们这个研究主要是关注于非小细胞肺癌驱动基因的肿瘤异质性，主要有一下三点发现：
1，揭示了肿瘤异质性是目前肿瘤耐药的重要原因之一。肿瘤的瘤内异质性如EGFR的瘤内异质性已经被很多的研究证实了，而我们的研究则证实了ALK融合基因也存在肿瘤异质性，众所周知，ALK融合基因和EGFR突变是目前非小细胞肺癌最重要的两大驱动基因，以上基因的瘤内异质性提示此异质性可能普遍存在于肿瘤当中，这一点仍需更多的研究来证实；
2， 我们的研究发现了2例双驱动的非小细胞肺癌患者，我们假设双驱动的肿瘤并不是每一个肿瘤细胞都含有这2种驱动基因，而可能是与肿瘤不同克隆来源的肿瘤细胞的分化发展有关，也就是说，有一部分亚克隆来源的肿瘤细胞可能是含有某一种驱动基因，另一些还有另一种，有一部分是两者都有，甚至有一部分是两者都没有。我们用不同的检测手段证实了这一假设；
3， 肺腺癌的组织异质性非常高，这一点已得到广大研究者尤其是病理科研究者的认可，然而，大家并未意识到它的分子异质性也是很高的，意味着病理与分子的异质性是共存的，但这种共存目前尚无规律可循，尚需更多的研究来探索。
肿瘤资讯：肺腺癌的研究进展和治疗进展日新月异，从研究者的角度，您认为这项研究对于临床治疗会有哪些启示？
蔡微菁博士：我们刚刚讲到，靶向药物可以给患者很大的收益，但是总生存时间的获益却仍不显著。所以在既往的研究中，我们把耐药机制的探索集中在二次突变或者信号分子的调控上面。而我们这个研究是向大家揭示异质性可能也是靶向药物耐药的一个很重要的机制之一。肿瘤的发生和发展是一个非常动态的过程，我们不能用临床上某一时间点对某一部位的一次活检来指导患者自始至终的整个治疗，这达不到精准治疗的要求，患者也达不到最大的获益。所以，我们了解到它存在动态异质性，异质性跟动态发展有关，也就是不同亚克隆来源的肿瘤细胞有不同的分化发展过程，在治疗选择和微环境改变的情况下，它有可能此消彼长，新优势生长的克隆亚群对靶向药物耐药，提示临床上可能还是需要多点活检或多次活检，不能用某一时间段的活检来指导整个治疗过程。这是本研究的主要提示。
除此之外，双驱动越来越多的被诊断出，而此类患者的治疗方式却仍无定论。我们的研究为此类患者的治疗提供了一定的理论基础，而其应用于临床仍需后续研究证实。药物的叠加势必带来副作用的叠加，这都需要临床实验来确定。
最后，本研究提示我们，肿瘤的复杂程度不可小觑。在抗击肿瘤的过程中，我们需要考虑得更为全面，研究得更为深入。而我们所做的也只是抛砖引玉，仅仅揭示了肿瘤异质性的冰山一角。
肿瘤资讯： 在您的研究中，涉及大量的标本检测工作，包括对于组织标本的微切割，能谈谈看您认为在进行这项研究的过程中，您遇到的最大困难吗？您是如何克服这些困难的？
蔡微菁博士：我们的研究是在组织异质性的基础上假设分子异质性的存在，最大的困难在于研究的实验设计。在我的导师周彩存教授的指导下，整个研究的设计与执行都走向了非常正确的方向。除了研究设计以外，最大的困难是涉及的样本的显微微切割。因为本研究需要我们要在显微镜的直视下，在区分腺癌亚型的情况下进行区域的分割，区别于传统的显微微切割，我们的切片厚度只能是传统的一半；但是，另一方面，我们又要保证切割到的肿瘤细胞足够多，它的生长形式足够单一，以便我们进行下一步的分析和检测，做到这两点的平衡还是很难的。为了要精确地掌握这一点，我们历经了无数次预实验和无数次失败才掌握这一点，非常熟练掌握了之后再进行有效的切割。这个过程当中，病理科的林冬梅教授对我们的帮助非常大，她对我们的指导，对于病理切片精确的读片，是对我们的实验能够进行和完成非常重要的一个保障。她的工作在本研究中起到了不可或缺的作用。
肿瘤资讯： 如果有其他学者也在从事肺癌的转化研究，希望您给到1-2点建议的话，您会做什么样的建议？
蔡微菁博士：这个研究的过程告诉我们，研究不是独立存在的，而是相互关联。就像本研究即建立在我们前期对融合基因的一系列探索之上。不断地遇到的问题，才会不断地提出新的假设进而去验证。所以我很想和研究的同行分享一点：研究需要专一，在一条道路上比较专注地，由浅入深地，把自己的东西做好，就是要专心致志地做自己的东西，不能急于求成，不能一口气吃成胖子，这是一个很漫长的过程。新的发现势必建立在旧的基础之上。即使我们现在所取得的成果也是建立在无数次的失败与探索之上，许多前人对于双突变以及异质性的研究也对我们很有指导意义。我们的研究也是为今后的人提供了基础和参考，供人超越，研究也是一种传承。
https://www.liangyihui.net/doc/d ... mp;isappinstalled=1








ALK阳性非小细胞肺癌克唑替尼的耐药机制及应对策略
间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因是继EGFR基因突变后在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中发现的又一具有针对性靶向药物治疗的肿瘤驱动基因。针对ALK融合基因的靶向治疗药物——克唑替尼，在短短4年内即经历从临床前研究、早期临床研究到批准上市的历程，是靶点明确、检测方法成熟的靶向药物成功的典范。

然而，一如EGFR突变基础上的EGFR-TKIs治疗耐药不可避免，尽管克唑替尼在ALK阳性患者获得良好的无进展生存和客观有效率，最终还是难逃耐药而治疗失败的命运。有关ALK+NSCLC靶向治疗的耐药机制及治疗策略已经成为目前的热点。

一、ALK+NSCLC获得性耐药的机制

ALK基因重排发生于3%-7%的NSCLC，更多见于非吸烟的较年轻腺癌患者，通常与EGFR或KRAS突变的发生互相排斥。NSCLC患者ALK基因重排的发现极大改善了该类亚型患者的临床预后。克唑替尼治疗的客观有效率（objective response rate，ORR）达60%，无进展生存（progression-free survival，PFS）达8-10个月，总生存显著延长。尽管ALK+肺癌患者的获益明显，但这部分患者往往在1-2年内出现对克唑替尼耐药，且中枢神经系统的复发进展较为常见。其耐药机制是多种多样的，可分为两大类：ALK耐药突变和其他信号通路的转换（即信号旁路的激活）。已发现的耐药机制主要有以下几种：

1. ALK耐药突变

（1） ALK激酶区突变：已有体外及基于患者标本的研究揭示部分ALK+肺癌患者对克唑替尼的耐药机制，其中最早明确的耐药机制是ALK激酶区突变。众所周知，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变阳性患者最主要的耐药机制是T790M突变，与之不同的是，ALK基因重排患者中已鉴定出数种ALK激酶区突变，数量上略微占优势的为L1196M，一种类似于T790M的看家基因。事实上，已在ALK激酶区鉴定出多种不同的氨基酸位点突变，包括L1196M，G1269A，S1206Y，G1202R，1151Tins，L1152R和C1156Y。Doebele等对14例经克唑替尼治疗出现获得性耐药的ALK+NSCLC患者的标本进行检测，发现三分之一患者出现了ALK激酶区的二次突变。与之相似，Katayama等对18例克唑替尼获得性耐药的患者进行临床和分子生物学特点进行分析，提示约三分之一患者出现了ALK激酶区的二次突变或ALK基因扩增，并且在体外实验中证实了这些突变导致了对克唑替尼的耐药。

耐药突变的多样性给患者和医生提出了挑战。首先，寻找能够鉴定所有已知突变的精确检测方法非常困难。其次，在出现耐药时，肿瘤组织可能具有不止一种突变。在首例公开报道的克唑替尼耐药病例的同一个肿瘤样本中即发现两种不同的突变（C1156Y和L1196M）。当肿瘤标本具有多种突变时，如果在大部分肿瘤细胞中没有一种占主导地位的突变，直接测序法可能会得出假阴性的结果。

（2） ALK融合基因拷贝数增加：ALK融合基因拷贝数增加首次是在ALK+细胞系出现对克唑替尼耐药时发现。其后在对克唑替尼耐药的患者标本中亦发现拷贝数的增加，提示其在肿瘤细胞耐药中可能具有一定的作用。当ALK融合基因激酶区突变或拷贝数增加时，ALK信号通路往往会保留，因此预期肿瘤细胞仍具有对ALK融合基因的成瘾性。这样，更强有效的第二代ALK抑制剂也许能够克服此种细胞耐药机制。该类型耐药被称为ALK-占优势的耐药。

2. 信号旁路的激活

（1）其他信号通路的转换（信号旁路的激活）：还有一种类型被称为其他信号通路的转换（信号旁路的激活），主要是指其他信号通路出现取代了肿瘤细胞对ALK通路的依赖，导致ALK抑制剂不能充分抑制肿瘤细胞生长。该类型耐药又被称为ALK-不占优势的耐药。已鉴定出多种替代的信号通路，如：在未接受克唑替尼和已接受克唑替尼治疗的患者中均发现激活的EGFR或KRAS突变的存在。体外研究提示，EGFR和其他的HER家族受体酪氨酸激酶能够通过配体介导激活ALK受体而导致耐药。其中占第一位的信号旁路即EGFR通路，在多项研究中均有报道。在麻省总医院18例对克唑替尼获得性耐药的标本中，17例标本经免疫组织化学方法检测出EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。更重要的是，在细胞系研究中发现，抑制EGFR可使耐药细胞系对克唑替尼恢复敏感性。第二位被激活的信号旁路是c-KIT通路。在麻省总医院18例对克唑替尼获得性耐药的标本中，2例标本经FISH方法检测发现高水平的c-KIT基因扩增。进一步通过免疫组化确认存在c-KIT过表达。另外，通过免疫组化法还发现在耐药标本实性成分的间质细胞中c-KIT配体干细胞因子（SCF）表达增加。体外实验证实c-KIT过表达需要SCF来促进其耐药，而该种耐药可通过联合伊马替尼与克唑替尼而逆转。

（2）肿瘤的异质性：当试图克服ALK+肺癌对克唑替尼的耐药性时，肿瘤异质性导致这一问题更加复杂。事实上，已在多种细胞耐药上观察到肿瘤的异质性。一个患者的标本中鉴定出两种不同的激酶区突变，而有一部分肿瘤细胞不存在突变。另外一个患者的标本同时鉴定出拷贝数增加和突变，但目前并不知道这些变异是否都存在于相同的细胞内。还有，一个患者同时进行了两个不同病灶的活检，显示出每个活检部位存在不同的分子结果。问题就不可避免的出现了：一小块活检组织的分子检测结果能否代表整个肿瘤组织，目前的有限的分子检测能否揭示所有细胞耐药的类型。这将使耐药后的分子机制的检测和制订相应的治疗策略更加复杂化。

二、克服ALK+NSCLC获得性耐药的药物与策略

1.第二代ALK抑制剂 临床前研究已证实，第二代ALK抑制剂（如CH5424802）不仅对于存在EML4-ALK融合基因的肿瘤细胞具有活性，而且对已鉴定出来的多种ALK激酶区耐药突变均具有活性。LDK378、AP26113和CH5424802的早期临床前数据提示这些药物对未接受克唑替尼治疗和克唑替尼耐药的患者均具有活性，并且每种药物均有部分数据支持其对脑转移灶有效。

LDK378是由诺华公司研发的ALK抑制剂，体外研究发现其对ALK酶的半抑制浓度（IC50）仅为0.15nM，而对照药物克唑替尼则为3nM，显示出针对ALK的较好活性。进一步在对ALK耐药细胞系研究，提示该药较克唑替尼有更好的活性。基于此，研究者设计了Ⅰ期临床研究（NCT01283516），筛选ALK阳性的经过标准治疗失败的进展期肿瘤患者入组，LDK378的剂量由50mg/d爬升至750mg/d。研究共入组131例患者，分为3组：之前接受过ALK TKI治疗的ALK+肺癌，之前未接受过ALK TKI治疗的ALK+肺癌和ALK+的除肺癌之外的其他恶性肿瘤。截止2012年11月8日，共入组130例患者，其中59例为剂量爬坡组，确认最大耐受剂量（MTD）为750mg/d；后续71例患者为MTD扩展组。接受LDK378剂量范围为400~750mg/d的114例NSCLC患者可评价疗效，ORR为58%（66例经过疗效确认，尚有20例疗效未经确认，未计算入内）。在79例对克唑替尼耐药的ALK+NSCLC亚组中，ORR为57%（45例经过疗效确认，17例疗效未经确认，未计算入内）。剩余35例未经克唑替尼治疗的ALK+NSCLC组中，ORR为60%（21例经过疗效确认，尚有3例疗效未经确认，未计算入内）。研究显示LDK378对患者中枢神经系统病灶亦有较好的疗效。在全组114例NSCLC中，中位PFS为8.6个月（95%可信区间：5.7~9.9）。最常见的不良反应（n=130）为恶心（73%），腹泻（72%），呕吐（58%）和乏力（41%），最常见的G3/4不良反应为丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高9%），门冬氨酸氨基转移酶（AST）升高（10%）和腹泻（8%）。该项研究结果表明LDK378在400~750mg/d剂量范围内显示出较强的抗肿瘤活性（无论其是否接受过克唑替尼治疗），并且对中枢神经系统病灶亦有活性；最常见的不良反应为恶心，腹泻，呕吐和乏力，且多为1或2级，患者耐受性佳。经FDA批准，LDK378正在进行多项Ⅱ期和Ⅲ期临床研究。

CH5424802是由中外制药公司研发的第二代ALK抑制剂之一，在日本进行的Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，最大耐受剂量组共纳入46例ALK+且未接受过克唑替尼治疗的NSCLC患者，其中43例获得客观缓解（2例为CR，41例为PR），客观缓解率93.5%，CI 82%~98.6%。12/46（26%）患者发生3级以上不良反应，包括中性粒细胞减少和血液肌酸激酶含量升高。

AP26113是由阿瑞雅德制药公司研发的新型小分子靶向药物，为ALK和EGFR双靶点抑制剂，同样在早期研究中显示出针对ALK+NSCLC患者较好的疗效，客观有效率高达73%，无论之前是否接受过克唑替尼治疗。综上，第二代ALK抑制剂对于仍依赖于ALK信号通路作为驱动基因的肿瘤也许是最佳的选择。

2.合理的联合治疗或化疗 由于尚存在信号旁路激活所导致的耐药，同时应用ALK抑制剂和其他信号传导通路，有可能改善临床疗效。具有前景的策略包括：ALK抑制剂联合热休克蛋白90（HSP 90）抑制剂/MEK抑制剂/mTOR抑制剂/EGFR抑制剂。

其中一个有前景的治疗策略是利用Ganetespib药物阻断分子伴侣热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）。在体外细胞系研究中发现Ganetespib对ALK+的未经过克唑替尼处理或对克唑替尼耐药的细胞系均有活性。HSP 90抑制剂能够促进肿瘤信号通路蛋白的降解，例如ALK（涉及肿瘤细胞的增殖和存活），为克唑替尼耐药但未发生二次突变患者的患者提供了一种可能的治疗策略。一系列联合HSP90抑制剂与选择性ALK抑制剂的临床研究正在进行中（NCT 01712217和NCT01579994）。

对于ALK+NSCLC，何种化疗药物是最佳的选择，已有多项研究报道，结果显示克唑替尼对ALK+肺癌的ORR可高达65.7%（n=172），而培美曲塞方案化疗ORR仅为29.3%（n=99），多西他赛方案疗效最差，ORR仅为6.9%（n=72）。含培美曲塞的方案显示出对ALK+肺癌的较好活性，当对克唑替尼耐药的患者不能参加其他临床研究时，培美曲塞亦可作为合理的选择之一。

在EGFR突变阳性NSCLC患者对EGFR TKI耐药后的相关研究发现，立即停止EGFR TKI治疗可导致肿瘤出现“暴发性进展”或称之为“闪耀”现象，可能的原因是停止EGFR TKI治疗后，对EGFR TKI敏感的快速生长细胞再次增殖，导致肿瘤暴发性生长。与之相似，对克唑替尼敏感的ALK+NSCLC亦可能出现相似的过程。因此，当该类患者出现对克唑替尼获得性耐药时，在全身化疗同时是否需要继续克唑替尼治疗，尚无确切答案，通过一些前瞻性临床研究有助于回答这一问题。正在设计的SWOG1300研究即是针对ALK+患者出现克唑替尼耐药后随机分配至培美曲塞单药或培美曲塞与克唑替尼联合治疗组。值得关注的是，在这项研究中，如果单药培美曲塞治疗失败后，将允许患者再次接受克唑替尼治疗。基于此研究，亦能回答“在具有明确肿瘤驱动基因的患者出现获得性耐药后，两种不同的治疗模式孰优孰劣（继续原小分子靶向药物联合全身化疗vs先全身化疗，待疾病再次进展后重新“挑战”小分子靶向药物——rechallenge）”这一问题。研究结果对临床实践具有重要的指导意义，我们将拭目以待。

3.不同耐药模式的治疗策略 当具有驱动基因的NSCLC接受靶向药物治疗出现疾病进展时，应根据不同的情况制定后续的治疗策略。对于靶向药物治疗出现获得性耐药的这部分病人，一个重要的观点是认为这种耐药往往不完全，因此当疾病进展时，仍有部分肿瘤细胞能够继续被靶向药物所抑制。在更改治疗方式之前，区分出仅可检测的疾病进展与临床显著进展非常重要。这是由于某些患者虽然出现了局部的、无症状性进展，但与接受靶向治疗之前相比，肿瘤负荷仍能有较好的控制。还有些病人发现疾病进展后停用TKI，出现了疾病暴发性进展。这时予患者同一种TKI或作用于同一靶点的不同种TKI，疾病可再次获得良好控制。该现象说明TKI仍能抑制对其敏感的肿瘤细胞亚群。因此，区分不同的耐药模式对后续治疗至关重要。疾病进展仅出现于局限的一个或几个病灶时，利用局部治疗手段（如放疗、手术或射频消融治疗）同时继续克唑替尼似乎是更佳的选择。其中最具有代表性的范例即是局部脑转移的进展。患者往往除脑部病灶外，全身病灶均控制尚可，而脑转移灶进展可能是由于血脑屏障的存在，导致脑脊液中TKI药物浓度较低所致。如疾病仅仅是缓慢或非常小的进展，建议继续目前的治疗，并密切随访。如疾病出现迅速广泛进展时，说明TKI已经不能抑制肿瘤生长，建议停用靶向药物治疗。对于此类病人，再次活检可能会发现组织学改变或新的突变，有助于据此来选择有效的药物。

肿瘤驱动基因的发现及相应靶向药物的应用，极大地改善了患者的预后。然而，肿瘤细胞之固有特点必将使得治疗之路漫漫且修远，吾辈仍需上下求索！

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